Il percorso espositivo si apre con un nucleo di opere provenienti dal soppresso Museo della Basilica di Sant'Ambrogio, dove era esposta una serie di oggetti nella maggior parte dei casi legati alla storia della basilica o del santo patrono di Milano.
Tra questi, viene oggi presentato al Museo Diocesano, simbolicamente esposto all'inizio della prima sala, il grande clipeo con il Busto di Sant'Ambrogio benedicente, attribuibile al X secolo.
Di grande valore storico artistico sono anche i frammenti delle imposte lignee del portale maggiore della basilica di Sant'Ambrogio, risalenti al IV-VI secolo. Interessante dal punto di vista della storia della devozione è invece la cosiddetta Lettiera di Sant'Ambrogio, databile al IV secolo, dove, secondo la tradizione, sarebbe stato esposto alla venerazione dei fedeli il corpo del santo durante le esequie avvenute nella stessa basilica. Oltre ai rilievi lignei provenienti dal coro quattrocentesco di Sant'Ambrogio, si possono vedere alcuni affreschi anch'essi in origine collocati in chiesa, le Pie donne e il Cristo portacroce, quest'ultimo recentemente attribuito ad Andrea Solario.