La collezione del Museo Diocesano comprende circa 600 opere, di cui quasi 400 esposte, suddivise in alcune sezioni.
Dalla Quadreria arcivescovile sono giunte al Museo molte opere delle collezioni degli arcivescovi milanesi, rivelando così i diversi orientamenti culturali dei vari successori di Ambrogio alla cattedra episcopale; in museo sono esposte, per esempio, parte della collezione Monti, della Visconti, della Pozzobonelli, e la completa collezione Erba Odescalchi.
Il Museo Diocesano conserva inoltre numerose opere provenienti dalla Diocesi, dal VI al XIX secolo: in seguito ad uno studio minuzioso dell'Archivio dei beni Artistici della Diocesi, dal 1998 conservato presso il Museo, prima dell'inaugurazione sono state effettuate indagini e sopralluoghi nelle varie parrocchie che hanno consentito di individuare veri e propri tesori nascosti. Si è avviata quell'azione di recupero e valorizzazione del patrimonio artistico della Diocesi che è uno dei principali obiettivi del Museo Diocesano. A questo nucleo si aggiungono la sezione dedicata a Sant'Ambrogio, i Fondi Oro (opere di ambito per lo più toscano del XIV e XV secolo, raccolte dal prof. Alberto Crespi e donate al Museo nel 2000), le sculture e i dipinti provenienti dalla collezione Marcenaro (depositata dalla Fondazione Cariplo nel 2004), il ciclo di tele dell'Arciconfraternita del Santissimo Sacramento ed infine un gruppo significativo di opere di arredo liturgico. Nell'immediato futuro, si prevede una sezione interamente dedicata al Novecento. Le raccolte del Museo comprendono già opere di artisti del Novecento (Lucio Fontana, Aldo Carpi, William Congdon e altri), per ora per lo più conservate nei depositi.